Удосконалення методів профілактики ентеробактеріозів бджіл

Abstract

Дисертація присвячена дослідженню інфекційних хвороб бджіл, зокрема ентеробактеріозів (дисбіозів), у Північно-Західному регіоні України. Удосконалено методи виділення та ідентифікації збудників ентеробактеріозів бджіл – мікроорганізмів видів Klebsiella pneumoniae та Klebsiella (Enterobacter) aerogenes. Проведено пошук ефективних засобів щодо нейтралізації вищевказаних збудників. Вивчена та сформована патогенетичної картина розвитку клебсієльозу у бджіл. Вивчений вплив пробіотиків та дезінфектантів in vitro та визначено дію «ЕМ® ПРОБІОТИКа для БДЖІЛ» на морфологічні, деякі біохімічні показники гемолімфи і тривалість життя робочих бджіл української степової породи in vivo. Удосконалені оптимальні схеми для проведення лікувально-профілактичних заходів за дисбіозів бджіл. Для характеристики епізоотичного стану щодо заразних захворювань бджіл була проведена систематизація та аналіз офіційних даних управлінь Держпродспоживслужб Житомирської, Рівненської та Волинської областей за 2019 – 2022 роки. У Волинській області встановлена тенденція щодо зменшення діагностичних досліджень хвороб бджіл у 2021 та 2022 роках, порівняно із 2019 роком. Щорічне збільшення кількості діагностичних досліджень зареєстровано у Житомирській та Рівненській областях. Максимальні показники інфікованості щодо вароозу – 30,24% (2021 рік) – встановлено у Волинській області; ноземозу – 7,45% (2019 рік) у Рівненській області; американського гнильця – 0,81% (2019 рік) у Житомирській області. Важко описати поширеність заразних хвороб комах, спираючись лише на планові дослідження. Перспективним є удосконалення системи моніторингу інвазійних, вірусних та бактеріальних хвороб бджіл. У дисертаційний роботі представлені сучасні методи ізоляції, ідентифікації та індикації чистих культур патогенних бактерій бджіл видів Klebsiella pneumoniae та Klebsiella (Enterobacter) aerogenes. Лабораторна діагностика дисбіозів бджіл включає: 1. Висів патологічного матеріалу, відібраного від хворих бджіл, на елективні поживні середовища для ентеробактерій та виділення чистої культури; 2. Мікроскопія типових колоній; 3. Визначення родової належності; 4. Визначення рухової активності бактерій: 5. Тест на уреазу; 6. Тест на індол; 7. Фенілаланіновий тест; 8. Дослідження основних ферментативних властивостей бактерій (біохімічне типування). За культуральними, морфологічними, тинкторіальними властивостями та результатами біохімічного типування мікроорганізми культури № 1 належать до Родини Enterobacteriaceae, Роду Klebsiella та Виду Klebsiella pneumoniae. Мікроорганізми культури № 2 належать до родини Enterobacteriaceae, роду Klebsiella та виду – Klebsiella (Enterobacter) aerogenes, що встановлено за аналогічною схемою. Запропонований нами алгоритм дозволяє чітко та економічно діагностувати дисбактеріози у бджіл. За аналогічною схемою нами були виділені та ідентифіковані бацили виду Bacillus subtilis із 5 видів медів (липового, гречаного, квіткового, лісового, акацієвого). Випробовування препаратів in vitro щодо тест-культур ентеробактерій бджіл видів Klebsiella pneumoniae та Klebsiella (Enterobacter) aerogenes були першим етапом пошуку ефективних засобів щодо лікування та профілактики дисбіозів бджіл. Дослідження проводили диско-дифузійним методом та методом лунок. Оцінювали антагоністичну активність Bacillus subtilis, виділеної з медів різних видів (липового, гречаного, квіткового, лісового, акацієвого), щодо тест-культури бджіл виду Klebsiella pneumoniae. Найбільш дієві ізоляти виділені з акацієвого (47,2±0,48 мм) та лісового медів (36,6±0,24 мм). Тому, Bacillus subtilis може представляти собою альтернативний компонент при терапії та профілактиці ентеробактеріозів (дисбіозів) бджолиних колоній. Надалі визначали ефективність дезінфекційних засобів щодо ентеробактерій бджіл видів Klebsiella pneumoniae та Klebsiella (Enterobacter) aerogenes диско-дифузійним методом. Вивчали вплив дезінфектанту «Йодіс дез №2» на досліджувані культури ентеробактерій бджіл. Даний дезінфекційний засіб мав бактеріостатичну дію на мікроорганізми видів Klebsiella pneumoniae (від нативного до 1:100) та Klebsiella (Enterobacter) aerogenes (від нативного до 1:10). Через 14 діб зберігання дезінфектанту його антимікробна активність стрімко падала з діаметром зони пригнічення росту 10 та 8 мм (у розведеннях від нативного до 1:5) щодо бактерій виду Klebsiella pneumoniae. Також нами досліджена активність розчину міді і цитрату срібла щодо тест-культур та змішаної мікробної асоціації. Найбільш активний вплив даного засобу реєструвався при нативному застосуванні на усі вищевказані культури, причому зона просвітлення у змішаній культурі була достовірно більшою (на 28,8%), ніж у чистій культурі виду Klebsiella pneumoniae (14,14±0,35 мм). Так, перспективним є удосконалення складу дезінфектантів («Йодіс дез №2» та «Розчин міді і цитрату срібла») з метою посилення бактерицидного впливу на патогенні ентеробактерії бджіл. Пробіотики – засоби, які у своєму складі містять мікроорганізми, що у певному кількісному та якісному співвідношенні сприятливо впливають на організм. Активність «Ентеронормін з Йодіс + Se» щодо бактерій виду Klebsiella (Enterobacter) aerogenes та Klebsiella pneumoniae розведеного медовими ситами (медовими сиропами) з акацієвого та лісового медів вивчали диско-дифузійним методом. Зареєстрований найбільший бактеріостатичний ефект щодо ентеробактерій виду Klebsiella (Enterobacter) aerogenes при розведеннні препарату ситою з акацієвого меду (27,9±0,48 мм). На культури виду Klebsiella pneumoniae найактивніше діяв препарат, розведений ситою із лісового різнотрав’я з діаметром зони пригнічення росту 28,50±0,57 мм. Дані результати свідчать про можливість розведення «Ентеронормін з Йодіс + Se» ситами із даних видів медів з профілактичною метою у складі комплексної терапії за ентеробактеріозів бджіл. Дослідження дії «ЕМ® ПРОБІОТИК для БДЖІЛ» in vitro щодо бактерій бджіл виду Klebsiella pneumoniae, Klebsiella (Enterobacter) aerogenes та змішаної мікробної асоціації здійснювали методом дифузії в агарових лунках та диско-дифузійним методом. ЕМ® ПРОБІОТИК для БДЖІЛ» застосовували у нативному стані і в таких концентраціях – 0,5%; 1%; 2,5%; 5%; 10%; 20%; 30%; 50%. Розводили 50% розчином цукрового сиропу та водою. Бактеріостатичний ефект щодо ентеробактерій виду Klebsiella pneumoniae зберігався на однаковому рівні при розведенні 50% розчином цукрового сиропу у концентраціях від 0,5% до 30%. Розведення «ЕМ® ПРОБІОТИКа для БДЖІЛ» водою мало виражений антагоністичний вплив щодо бактерій виду Klebsiella pneumoniae методом лунок на третю добу експерименту при концентраціях 0,5% – 75,4±1,04 мм, 1% – 61,2±0,42 мм. При розведенні пробіотика 50% цукровим сиропом відмічали бактеріостатичну дію щодо ентеробактерій виду Klebsiella (Enterobacter) aerogenes у концентраціях до 50% у межах від 18,2±0,42 мм до 25,4±0,45 мм (диско-дифузійний метод). Бактерицидна дія відмічена при 10% концентрації препарату розведеного водою з діаметром зони просвітлення 18,6±0,57 мм щодо змішаної мікробної асоціації диско-дифузійним методом. «ЕМ® ПРОБІОТИК для БДЖІЛ» має антагоністичний, бактеріостатичний та бактерицидний ефекти щодо досліджуваних ентеробактерій бджіл і змішаної мікробної асоціації in vitro. Наступним етапом стало вивчення дії даного пробіотика на організм робочих бджіл зимової генерації української степової породи в садковому експерименті (in vivo). Вплив «ЕМ® ПРОБІОТИК для БДЖІЛ» на збереженість життя визначали шляхом щоденного аналізу і підрахунку кількості загиблих комах в ентомологічних садках. Препарат розводили медовою гречаною ситою та розчином цукрового сиропу у концентраціях 5%; 2,5%; 1,25%; контрольні групи бджіл отримувати нативні розчини цукрового сиропу та гречаної медової сити. Зареєстрована сприятлива дія препарату розведеного цукровим сиропом у концентраціях 1,25%–5%, що призводить до збільшенні тривалості їх життя до 18 та 16 діб, відповідно. При розведенні препарату медовою гречаною ситою найдовша тривалість життя комах зареєстрована при концентрації 1,25% (14 діб), порівняно із контрольною групою бджіл. Про перевагу цукрового сиропу як розчинника для «ЕМ® ПРОБІОТИК для БДЖІЛ» у порівнянні з гречаною медовою ситою в лабораторних умовах свідчить показник коефіцієнта середньої тривалості життя бджіл. Надалі вивчали вплив даного пробіотика на морфологічні показники та деякі біохімічні параметри гемолімфи бджіл. Гемолімфу для морфологічних досліджень відбирали з грудної та черевної ділянок Морфологічний склад гемолімфи вивчали на 7 та 10 добу експерименту. При розведенні «ЕМ® ПРОБІОТИК для БДЖІЛ» гречаною медовою ситою виявлено, що кількість гемоцитів гемолімфи всіх дослідних груп варіювала з гемограмою бджіл контрольної групи. Задавання 5% пробіотика, розведеного медовою гречаною ситою, стимулювало синтез сферулоцитів, 2,5%−на концентрація активізувала синтез імунокомпетентних клітин, а 1,25%−на впливала на диференціацію прогемоцитів до фагоцитарних клітин здатних до імунної відповіді. Найвищу концентрацію фагоцитарних клітин (72,4±0,45%) зареєстровано у бджіл, які отримували 1,25%−ний розчин «ЕМ® ПРОБІОТИКа для БДЖІЛ» розведеного цукровим сиропом. Так, «ЕМ® ПРОБІОТИК для БДЖІЛ» має стимулюючу та імуностимулюючу дії щодо робочих бджіл зимової генерації української степової породи. Деякі біохімічні параметри гемолімфи бджіл (загальний білок, альбуміни, глюкозу, α-амілазу, лужну фосфатазу, аспартатамінотрансферазу, гамма-глютамілтранспептидазу та креатинін) визначали на «граничну» добу відносно терміну їх загибелі. Деякі біохімічні показники бджіл дослідних груп (лабораторні умови) порівнювали з гемолімфою Apis mellifera контрольної (природні умови) групи з цієї ж пасіки. Нами визначені концентрації пробіотика, розведеного розчином цукрового сиропу, які зумовлюють підвищення вмісту глобулінів у гемолімфі дослідних комах, що має важливе імунологічне значення. Зареєстровано зниження вмісту креатиніну в гемолімфі експериментальних комах, які отримували «ЕМ® ПРОБІОТИК для БДЖІЛ» розведений розчином цукрового сиропу (5% – 780 мкмоль/л; 2,5% – 700,8 мкмоль/л; 1,25% – 623,4 мкмоль/л). Такі показники свідчать про задовільну роботу екскреторної системи дослідних бджіл. Таким чином, «ЕМ® ПРОБІОТИК для БДЖІЛ» диференційовано впливає на біохімічні показники гемолімфи бджіл у досліджуваних концентраціях при розведенні різними розчинниками. Заключним етапом дисертаційного дослідження стало удосконалення оптимальної лікувально-профілактичної схеми за ентеробактеріозів (дисбіозів) бджіл. З терапевтичною метою бджолам необхідно задавати: 0,15% розчин «Біоконтакту-плюс» (300–350 см3 препарату на 1 бджосім’ю) – 5 обробок через 3–4 доби та 2,5–5% розчин «ЕМ® ПРОБІОТИК для БДЖІЛ» (в дозі 300–400 см3 препарату на 1 сім’ю) – 3–4 обробки через 3–4 доби, де обидва засоби розведені 50% розчином цукрового сиропу. З профілактичною метою рекомендовано застосовувати «Ентеронормін з Йодіс + Se» – 20 см3 розведеного 200 см3 50% розчином цукрового сиропу (per os) – 3–5 разів з інтервалом 5 діб. «ЕМ® ПРОБІОТИК для БДЖІЛ» – 12–15 см3 препарату на 1 літр води (в дозі 10 см3 робочого розчину на 1 вуличку бджолиної сім'ї) – 2 обробки, з інтервалом 7–14 діб та дотримування загальних профілактичних заходів на пасіках.

The dissertation is about the research of infectious diseases of bees, in particular enterobacteriosis (dysbiosis), in the North-West region of Ukraine. Methods of isolation and identification of pathogens of enterobacteriaceae species Klebsiella pneumoniae and Klebsiella (Enterobacter) aerogenes have been improved. Effective means were searched for to neutralise the above pathogens The products found can be used for the prevention or treatment of this pathological of bees. We have studied and formed a pathogenetic profile for the development of Klebsiellosis in bees. The effect of probiotics and disinfectants in vitro was studied. The effect of the most effective preparation «EM® PROBIOTIC FOR BEES» on the morphological, some biochemical parameters of hemolymph and viability of worker honeybees the Ukrainian steppe breed in vivo was determined. The optimum schemes for treatment and prevention of dysbiosis (enterobacteriosis) in bees have been improved. In addition, a systematisation and analysis of official data from the Zhytomyr, Rivne and Volyn regions Departments of the State Production and Consumer Service for 2019 – 2022 was carried out to characterise the epizootic state of contagious diseases of bees. In the Volyn region, a downward trend in diagnostic tests for bee diseases in 2021 and 2022, compared to 2019, has been established. We have recorded an annual increase in the number of diagnostic tests in Zhytomyr and Rivne regions. The highest rates of infection were recorded in Volyn region for varroosis (30,24% – 2021); in Rivne region for nosemosis (7,45% – 2019); in Zhytomyr region for American foulbrood (AFB) (0,81% – 2019). It is difficult to describe the prevalence of contagious insect (bees) diseases on the basis of only routine tests. It is therefore promising to improve the monitoring system for invasive, viral and bacterial diseases of bees. This dissertation presents modern methods of isolation, identification and indication of pure cultures of pathogenic bacteria of Klebsiella pneumoniae and Klebsiella (Enterobacter) aerogenes. The laboratory diagnosis of the dysbiosis of bees are as follows: 1. Planting of pathological material from diseased bees on elective nutrient media for enterobacteria and isolation of pure culture; 2. Microscopy of typical colonies; 3. Definition of genus; 4. Definition of bacterial motility; 5. Urease test; 6. Indole test; 7. Phenylalanine test; 8. Investigation of basic enzymatic properties of bacteria (biochemical typing). According to cultural, morphological, tinctorial characteristics and results of biochemical typing, the microorganisms of culture No. 1 belong to the family Enterobacteriaceae, the genus Klebsiella and the species Klebsiella pneumoniae. The microorganisms of culture No. 2 belong to the family Enterobacteriaceae, the genus Klebsiella and the species Klebsiella (Enterobacter) aerogenes, which is established in a similar way. Our proposed algorithm allows us to enables a clear and economical diagnosis of dysbacteriosis in bees. We isolated and identified bacteria species Bacillus subtilis species from 5 types of honey (linden, buckwheat, flower, forest, acacia) in the same way. The first step in the search for effective treatments and prevention of bee dysbiosis was to test preparations on test cultures of enterobacteriaceae species Klebsiella pneumoniae and Klebsiella (Enterobacter) aerogenes in vitro. Research at this step was carried out using the disk diffusion method and the diffusion in agar wells (well method). We evaluated the antagonistic activity of Bacillus subtilis isolated from different honeys (linden, buckwheat, flower, forest, acacia) against a test culture of enterobacteriaceae species Klebsiella pneumoniae. The most effective isolates antagonists against Klebsiella pneumoniae were isolated from acacia honey (47,2±0,48 mm) and forest honey (36,6±0,24). Therefore, Bacillus subtilis can be an alternative component in the treatment and prevention of dysbiosis in bees. We tested the efficacy of disinfectants against bee enterobacteriaceae species Klebsiella pneumoniae and Klebsiella (Enterobacter) aerogenes by the disc diffusion method. The effect of the iodine-containing disinfectant «Jodis Des No. 2» against the tested cultures of enterobacteriaceae bees was determined. This disinfectant had a bacteriostatic effect agaist microorganisms of the Klebsiella pneumoniae (from native to 1:100) and Klebsiella (Enterobacter) aerogenes (from native to 1:10). After 14 days to storage the antimicrobial activity of the disinfectant decreased rapidly, the bacteriostatic effect and the diameter of the growth inhibition zone against a test culture of Klebsiella pneumoniae were 10 and 8 mm (from native to 1:5). We also investigated the activity of a sample of copper solution and silver citrate against test cultures and mixed microbial association. The most active effect sample of this solution was recorded in native application, and the bacterial growth inhibition zone in the mixed culture was significantly ginger (28,8%) than in the pure culture of Klebsiella pneumoniae species (14,4±0,35 mm). Therefore, the disinfectants «Jodis Des No. 2» and «Sample of copper citrate and silver citrate solution» need to be improved. The aim of the improvement is to enhance the bactericidal effect on pathogenic enterobacteriaceae bees. Probiotics are treatments that contain live microorganisms. These microorganisms can positively influence the body in central quantitative and qualitative proportions. The activity of the probiotic «ENTERONORMIN PLUS JODIS + SE» diluted with honey syrups from acacia honey and forest herb honey against bacteria from Klebsiella pneumoniae and Klebsiella (Enterobacter) aerogenes species was studied using the disc diffusion method. The highest bacteriostatic effect of probiotic diluted with acacia honey syrup (27,9±0,48 mm) against enterobacteriaceae species Klebsiella (Enterobacter) aerogenes was registered. «ENTERONORMIN PLUS JODIS + SE» diluted with honey syrup from forest herbs was active against bacterial cultures of Klebsiella pneumoniae species with a growth inhibition zone diameter of 28,05±0,57 mm. These results indicate the possibility of diluting «ENTERONORMIN PLUS JODIS + SE» with honey syrups from these types of honey for prevention purposes as part of complex therapy for enterobacteriosis of bees. Action «EM® PROBIOTIC FOR BEES» against bacteria of Klebsiella pneumoniae, Klebsiella (Enterobacter) aerogenes and a mixed microbial association was carried by diffusion in agar wells (well method) and disk diffusion method in vitro. «EM® PROBIOTIC FOR BEES» was applied in the native and in the concentrations 0,5%, 1%, 2,5%, 5%, 10%, 20%, 30%, 50%. The dilution was carried out with 50% sugar syrup solution and water. The bacteriostatic effect against enterobacteriaceae species Klebsiella pneumoniae was retained at the similar level when diluted with 50% sugar syrup solution in concentrations from 0,5% to 30%. «EM® PROBIOTIC FOR BEES» diluted with water demonstrated an antagonistic effect against Klebsiella pneumoniae test cultures in the agar well diffusion method on the third day of the experiment at a concentration of 0,5% – 75,4±1,04 mm and 1% – 61,2±0,42 mm. In dilution of probiotic with 50% sugar syrup was observed bacteriostatic action agaist bacteria species of Klebsiella (Enterobacter) aerogenes in the concentration of the preparation up to 50% in the range from 18,2±0,42 mm to 25,4±0,45 mm (disk diffusion method). Antibactericidal effect of «EM® PROBIOTIC FOR BEES» diluted with water against mixed microbial association was observed at 10% concentration with bactericidal diameter of 18,6±0,57 mm by disc diffusion method. «EM® PROBIOTIC FOR BEES» has antagonistic, bacteriostatic and bactericidal effects against Enterobacteriaceae of bee's species Klebsiella pneumoniae, Klebsiella (Enterobacter) aerogenes and against mixed microbial associations in vitro. The next stage of the PhD research was to investigate the effect of this probiotic of Ukrainian steppe worker bees of the winter generation in an wooden entomological cage experiment (in vivo). The effect of the «EM® PROBIOTIC FOR BEES» on bee viability was determined by daily analysis and counting the number of dead insects in a wooden entomological cage. The probiotic was diluted with buckwheat honey syrup solution and sugar syrup solution at concentrations of 5%; 2,5%; 1,25%; control groups of bees received native solution of the sugar syrup and buckwheat honey syrup. A beneficial effect of the probiotic diluted in sugar syrup at concentrations of 1,25% to 5% has been registered on the bee organism, which increased their lifespan to 18 and 16 days. When the product was diluted with buckwheat honey syrup, the longest viability of the insects was recorded at a concentration of 1,25% compared (14 days) to the control group of bees. The coefficient of average life expectancy of bees indicates the predominance of sugar syrup as a solvent for «EM® PROBIOTIC FOR BEES» compared to buckwheat honey syrup under laboratory conditions. We also investigated the effect of the «EM® PROBIOTIC FOR BEES» on the morphological and some biochemical parameters of the hemolymph. Hemolymph for morphological analysis was collected from the thoracic and abdominal regions of bee. The morphological composition of bee hemolymph was studied on days 7 and 10 of the experiment. By diluting «EM® PROBIOTIC FOR BEES» with buckwheat honey solution, it was found that the number of hemocytes in the hemolymph of all studied groups bees differed from the hemogram of control groups bees. Feeding 5% of the probiotic diluted with honey buckwheat syrup solution stimulated the synthesis of spherulocytes, 2,5% concentration activated the synthesis of different groups of immunocompetent cells. Feeding with 1,25% promoted the differentiation of prohemocytes into phagocytic cells capable of immune response. The highest concentration of phagocytic cells (72,4±0,45%) was observed in bees which received 1,25% solution of «EM® PROBIOTIC FOR BEES» diluted of sugar syrup solution. «EM® PROBIOTIC FOR BEES» has a stimulating and immune-stimulating effect on Ukrainian steppe bees of the winter generation. Some biochemical parameters of the bee's hemolymph were determined at the «limit» day in relation to the time of their death. Some biochemical parameters of the bee's hemolymph (total protein, albumin, glucose, α-amylase, alkaline phosphatase, aspartate aminotransferase, gamma-glutamul transpeptidase and creatinine) from experimental group (laboratory conditions) were compared with the hemolymph Apis mellifera of the control (natural conditions) group from the same apiary. We determined concentration of probiotic diluted with sugar syrup solution, which caused an increase in the content of globulins in the hemolymph of experimental insects, which has important immunological importance. There was a decrease in creatinine in the hemolymph of experimental insects, which had been fed «EM® PROBIOTIC FOR BEES», diluted with sugar syrup solution (5% – 780 µmol/l; 2,5% ̶ 700,8 µmol/l; 1,25% ̶ 62,4 µmol/l). Such indicators demonstrate the satisfactory functioning of the excretory system of the experimental insects. «EM® PROBIOTIC FOR BEES» a differentiated effect on biochemical parameters of bee hemolymph in the studied concentrations when diluted with different solutions. The final step of the PhD research was the improvement of the optimal treatment and prevention scheme for enterobacteriosis (dysbiosis) of bees. Based on our research it was found that treatment of bees it is necessary to apply 0,15% solution of «Biocontact Plus» (300–350 cm3 of preparation per 1 bee family) – 5 treatments 3–4 days and 2,5–5% solution of «EM® PROBIOTIC FOR BEES» (300–400 cm3 of preparation per 1 bee family) ̶ 3–4 treatments 3–4 days. «Biocontact Plus» and «EM® PROBIOTIC FOR BEES» must be diluted with 50% sugar syrup solution. For preventive purposes, we recommend «ENTERONORMIN PLUS JODIS + SE» – 20 cm3 diluted with 200 cm3 50% sugar syrup solution (per os) 3–5 times at 5-day intervals. «EM® PROBIOTIC FOR BEES» – 12–15 cm3 of this probiotic diluted with water – 2 treatments with interval of 7–14 days and compliance general preventive measures in apiaries.